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CRISPR/Cas產品暨服務簡介
CRISPR/Cas 相關產品暨服務區分為五大類，分述如下：
1. Two vector system: sgRNA expression vectors (C6-8-64 ~ C6-8-66)
此系列質體為sgRNA表現質體。其中，pU6-gRNA.Ppuro (C6-8-64) 載體為lentivector，由U6啟動子調控sgRNA的轉錄，可直接使用於細胞轉染，達到短期表現sgRNA的目標。此質體亦可以包裹成偽慢病毒(VSV-G-pseudotyped lentivirus)，以感染細胞的方式，配合Puromycin抗藥性篩選，可以快速得到細胞穩定株 (stable cell line)。而T3-gRNA (C6-8-65) 與T7-gRNA (C6-8-66) 等sgRNA表現質體，則適用於in vitro transcription之用途。這些sgRNA表現質體皆可以使用BsmBI限制酶移除1.9kb Stuffer sequence, 讓使用者可以自行cloning有興趣的sgRNA protospacer。 C6-8-73 ~ C6-8-75 為sgRNA control 質體。
2. Two vector system: Cas9 expression lentivectors (C6-8-52~C6-8-63)
此系列質體為表現Cas9 及其相關蛋白的表現質體。依據其Cas9功能性可以區分為以下五類：
● 雙股DNA剪切(double-strand break; DSB)：表現野生型Cas9蛋白，利用其RuvC-like與HNH內切酶活性進行雙股DNA剪切(詳細說明請見各質體產品資訊：C6-8-52及C6-8-58)。
● 單股DNA剪切(nick)：表現突變型Cas9 D10A蛋白或是FokI-dCas9蛋白，利用其nickase酵素活性進行單股DNA剪切(詳細說明請見各質體產品資訊：C6-8-53、C6-8-54、C6-8-59及C6-8-60)。
● 基因抑制(suppression)：表現突變型dCas9-KRAB fusion蛋白，利用KRAB repression domain干擾基因轉錄，以達到抑制基因表現的目標(詳細說明請見各質體產品資訊：C6-8-55及C6-8-61)。
● 基因活化(activation)：表現突變型dCas9-VP64 fusion蛋白，利用VP64 activation domain活化基因轉錄，以達到加強基因表現的目標 (詳細說明請見各質體產品資訊：C6-8-56及C6-8-62)。
● 基因標定(labeling)：表現突變型dCas9-EGFP fusion蛋白，利用EGFP標定基因位置 (詳細說明請見各質體產品資訊：C6-8-57及C6-8-63)。
3. All-in-one system sgRNA/Cas9 expression lentivectors (C6-8-67~C6-8-71)
此系列質體為可以同時表現sgRNA及Cas9(或Cas9相關蛋白)的All-in-one表現質體。依據其Cas9功能性可以區分為五類：雙股DNA剪切(C6-8-67)、單股DNA剪切(C6-8-68)、基因抑制(C6-8-69)、基因活化(C6-8-70)、以及基因標定(C6-8-71) 等用途。
4. pSurrogate reporter (C6-8-72)
此報導質體包含了表現EGFP蛋白的基因序列(in-frame) 及表現mCherry蛋白的基因序列(out-of-frame)。在EGFP基因序列與mCherry基因序列間設計了限制酶切位，使用者可以將有興趣的sgRNA-targeting sequence (包含PAM) 構築進入此報導質體。在正常表現情況下，只有綠色螢光(EGFP)可以表現，紅色螢光(mCherry)則不會表現。當使用者利用CRISPR進行基因編輯時，Cas9蛋白會在sgRNA-targeting sequence位置上進行剪切，細胞在進行DNA修補過程中有可能會產生indel，mCherry基因序列可能因此轉變成為in-frame，而使紅色螢光蛋白可以表現。使用者可以藉此驗證其sgRNA是否可以產生有效的基因編輯效能，亦可藉此報導質體的表現加速細胞篩選工作。
5. Customized CRISPR cloning service (C6-15-1)
本核心備有專人提供CRISPR相關技術諮詢，並提供sgRNA客製化服務。透過與使用者直接溝通的方式，根據使用者的基因標的(eg., cDNA, miRNA or lncRNA)、研究需求(eg., gene knock-out, gene knock-down or gene activation)以及sgRNA標靶位置(promoter, UTR or CDS)，設計符合其需求的sgRNA。針對每一個基因，核心會設計並提供四個不同的sgRNA表現質體以及二個control sgRNA質體。所有本核心所提供的sgRNA表現質體都會經過surrogate reporter實驗驗證, 並提供至少二個sgRNA表現質體可以有效產生indel(analysis by surrogate reporter)的服務保證。
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各個質體說明請見檔案下載區 > Vector資訊。Vector資訊提供質體map、質體說明、及質體"Features"
技術支援
1. Protocol
● sgRNA construction(Annealing method) (Protocol : sgRNA cloning Protocol V1)
● surrogate construction(Annealing method) (Protocol : Surrogate cloning Protocol V1)
2. CRISPR Introduction (CRISPR Introduction V1)
3. CRISPR technique supports (CRISPR technique supports V1)
產品分類
| Type of Cas9 Function |
Description |
ServiceId |
ServiceName |
Cut
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Wild type Cas9 efficiently generates double strand breaks (DSBs) at sgRNA-targeting sequence. |
C6-8-52 |
p5w.Cas9.Pbsd |
| C6-8-67 | pAll-Cas9.Ppuro |
Nick
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A mutated Cas9 (nickase version) generates a single-strand DNA break (Nick) at sgRNA-targeting sequence. |
C6-8-53 |
p5w.Cas9 D10A.Pbsd |
| C6-8-68 | pAll-Cas9 D10A.Ppuro |
Interfere
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A catalytically inactive Cas9 (dCas9) fused to a repressor domain can knockdown gene expression by interfering with transcription. |
C6-8-55 |
p5w.dCas9-KRAB.Pbsd |
| C6-8-69 |
pAll-dCas9-KRAB.Ppuro |
Activate
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A catalytically inactive Cas9 (dCas9) fused to an activator or HAT domain can increase or activate gene expression. |
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近期推出 |
Visualize
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A catalytically inactive Cas9 (dCas9) fused to a fluorescent protein EGFP can visualize specific genomic loci in the living cells |
C6-8-57 |
p5w.dCas9-EGFP.Pbsd |
| C6-8-71 |
pAll-dCas9-EGFP.Ppuro |
sgRNA
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Small guide RNA (sgRNA) can guide Cas9 protein to a specific genomic region through sequence complementarity. |
C6-8-64 |
pU6-sgRNA.pPuro |
| C6-8-65 |
pT3-sgRNA |
| C6-8-66 |
pT7-sgRNA |
| C6-8-73 | pEGFP-sgRNA 1 |
| C6-8-74 |
pEGFP-sgRNA 2 |
| C6-8-75 |
pLuc-sgRNA |
other
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Other useful CRISPR-related tools or constructs. |
C6-8-72 |
pSurrogate reporter |
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