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CRISPR
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CRISPR/Cas產品暨服務簡介
CRISPR/Cas 相關產品暨服務區分為五大類,分述如下:


1. Two vector system: sgRNA expression vectors (C6-8-64 ~ C6-8-66)
此系列質體為sgRNA表現質體。其中,pU6-gRNA.Ppuro (C6-8-64) 載體為lentivector,由U6啟動子調控sgRNA的轉錄,可直接使用於細胞轉染,達到短期表現sgRNA的目標。此質體亦可以包裹成偽慢病毒(VSV-G-pseudotyped lentivirus),以感染細胞的方式,配合Puromycin抗藥性篩選,可以快速得到細胞穩定株 (stable cell line)。而T3-gRNA (C6-8-65) 與T7-gRNA (C6-8-66) 等sgRNA表現質體,則適用於in vitro transcription之用途。這些sgRNA表現質體皆可以使用BsmBI限制酶移除1.9kb Stuffer sequence, 讓使用者可以自行cloning有興趣的sgRNA protospacer。 C6-8-73 ~ C6-8-75 為sgRNA control 質體。

2. Two vector system: Cas9 expression lentivectors (C6-8-52~C6-8-63)
此系列質體為表現Cas9 及其相關蛋白的表現質體。依據其Cas9功能性可以區分為以下五類:

 ● 雙股DNA剪切(double-strand break; DSB):表現野生型Cas9蛋白,利用其RuvC-like與HNH內切酶活性進行雙股DNA剪切(詳細說明請見各質體產品資訊:C6-8-52及C6-8-58)。

 ● 單股DNA剪切(nick):表現突變型Cas9 D10A蛋白或是FokI-dCas9蛋白,利用其nickase酵素活性進行單股DNA剪切(詳細說明請見各質體產品資訊:C6-8-53、C6-8-54、C6-8-59及C6-8-60)。

 ● 基因抑制(suppression):表現突變型dCas9-KRAB fusion蛋白,利用KRAB repression domain干擾基因轉錄,以達到抑制基因表現的目標(詳細說明請見各質體產品資訊:C6-8-55及C6-8-61)。

 ● 基因活化(activation):表現突變型dCas9-VP64 fusion蛋白,利用VP64 activation domain活化基因轉錄,以達到加強基因表現的目標 (詳細說明請見各質體產品資訊:C6-8-56及C6-8-62)。

 ● 基因標定(labeling):表現突變型dCas9-EGFP fusion蛋白,利用EGFP標定基因位置 (詳細說明請見各質體產品資訊:C6-8-57及C6-8-63)。

3. All-in-one system sgRNA/Cas9 expression lentivectors (C6-8-67~C6-8-71)
此系列質體為可以同時表現sgRNA及Cas9(或Cas9相關蛋白)的All-in-one表現質體。依據其Cas9功能性可以區分為五類:雙股DNA剪切(C6-8-67)、單股DNA剪切(C6-8-68)、基因抑制(C6-8-69)、基因活化(C6-8-70)、以及基因標定(C6-8-71) 等用途。

4. pSurrogate reporter (C6-8-72)
此報導質體包含了表現EGFP蛋白的基因序列(in-frame) 及表現mCherry蛋白的基因序列(out-of-frame)。在EGFP基因序列與mCherry基因序列間設計了限制酶切位,使用者可以將有興趣的sgRNA-targeting sequence (包含PAM) 構築進入此報導質體。在正常表現情況下,只有綠色螢光(EGFP)可以表現,紅色螢光(mCherry)則不會表現。當使用者利用CRISPR進行基因編輯時,Cas9蛋白會在sgRNA-targeting sequence位置上進行剪切,細胞在進行DNA修補過程中有可能會產生indel,mCherry基因序列可能因此轉變成為in-frame,而使紅色螢光蛋白可以表現。使用者可以藉此驗證其sgRNA是否可以產生有效的基因編輯效能,亦可藉此報導質體的表現加速細胞篩選工作。

5. Customized CRISPR cloning service (C6-15-1)
本核心備有專人提供CRISPR相關技術諮詢,並提供sgRNA客製化服務。透過與使用者直接溝通的方式,根據使用者的基因標的(eg., cDNA, miRNA or lncRNA)、研究需求(eg., gene knock-out, gene knock-down or gene activation)以及sgRNA標靶位置(promoter, UTR or CDS),設計符合其需求的sgRNA。針對每一個基因,核心會設計並提供四個不同的sgRNA表現質體以及二個control sgRNA質體。所有本核心所提供的sgRNA表現質體都會經過surrogate reporter實驗驗證, 並提供至少二個sgRNA表現質體可以有效產生indel(analysis by surrogate reporter)的服務保證。

# 各個質體說明請見檔案下載區 > Vector資訊。Vector資訊提供質體map、質體說明、及質體"Features"

技術支援


1. Protocol

● sgRNA construction(Annealing method) (Protocol : sgRNA cloning Protocol V1)

● surrogate construction(Annealing method) (Protocol : Surrogate cloning Protocol V1)

2. CRISPR Introduction (CRISPR Introduction V1)

3. CRISPR technique supports (CRISPR technique supports V1)

產品分類

Type of Cas9 Function Description ServiceId ServiceName

Cut
Wild type Cas9 efficiently generates double strand breaks (DSBs) at sgRNA-targeting sequence. C6-8-52 p5w.Cas9.Pbsd
C6-8-67pAll-Cas9.Ppuro

Nick
A mutated Cas9 (nickase version) generates a single-strand DNA break (Nick) at sgRNA-targeting sequence. C6-8-53 p5w.Cas9 D10A.Pbsd
C6-8-68pAll-Cas9 D10A.Ppuro

Interfere
A catalytically inactive Cas9 (dCas9) fused to a repressor domain can knockdown gene expression by interfering with transcription. C6-8-55 p5w.dCas9-KRAB.Pbsd
C6-8-69 pAll-dCas9-KRAB.Ppuro

Activate
A catalytically inactive Cas9 (dCas9) fused to an activator or HAT domain can increase or activate gene expression.   近期推出

Visualize
A catalytically inactive Cas9 (dCas9) fused to a fluorescent protein EGFP can visualize specific genomic loci in the living cells C6-8-57 p5w.dCas9-EGFP.Pbsd
C6-8-71 pAll-dCas9-EGFP.Ppuro

sgRNA
Small guide RNA (sgRNA) can guide Cas9 protein to a specific genomic region through sequence complementarity. C6-8-64 pU6-sgRNA.pPuro
C6-8-65 pT3-sgRNA
C6-8-66 pT7-sgRNA
C6-8-73pEGFP-sgRNA 1
C6-8-74 pEGFP-sgRNA 2
C6-8-75 pLuc-sgRNA

other
Other useful CRISPR-related tools or constructs. C6-8-72 pSurrogate reporter

 
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