服務約定條文與問答
 老師, 您好
申請客製化病毒服務說明書
一、送件需知
DNA純度與其完整性是影響Transfection效率與病毒力價高低因素之一。為了避免 日後的爭議,本核心特訂定客製化VSV-G peudotyped lentivirus需知如下:
1. 此服務只限制在核心領取的shRNA細菌株萃取之Lentiviral Transfer Vectors 或來自核心之其他Transfer Vectors及其衍生物;如Transfer Vectors非來自本核心則需是2.5 generation以上的lentivector。
2. 如selection marker 為非 puromycin acetyltransferase 者,將不提供病毒力價資料;
3. 希望您能理解並不是每個constructs 都可得到高力價的病毒,原因如下:
(1) shRNA/siRNA targeting病毒生產細胞株293T 或力價測定細胞株A549細胞株之 細胞必須因子、存活因子、或因而影響細胞活性者,預期病毒力價將低於平均 值或趨近於零。
(2) 根據 The RNAi Consortium (TRC) 未發表之資料顯示,在生產的 15,000 ORFs 慢病毒中約有 11% 之 ORF 無法產生病毒,原因不知但與 ORF 的長度沒有絕 對關係。本核心亦得到類似結果。
4. 送件DNA 經本核心執行病毒生產流程,不論最後結果如何 (低力價或無力價) 均需付費。
5. 欲申請客製化病毒服務之申請人,送件DNA(只需送 Transfer Vector)至少需完成 兩項測試(純度:OD260/280 and OD260/230 measurements;完整性:0.5% Agarose Gel Electrophoresis test)。如有必要,本核心亦會進行複測。欲送件之 DNA必須符合下 列說明條件,俟本核心審查通過後,始可提出申請。
二、 送件說明與表單
1. Plasmid DNA 的製備與其送件的量
Plasmid DNA建議使用Transfection-Quality純化試劑組或核心提供之純化方法 (Purification of plasmid DNA by precipitation with PEG 10000) 純化。
所需 DNA 量如下表。
服務項次 濃度# 送件體積(µl) 送件DNA量(µg)
C6-9-1 (1mL virus) 50 ng/µl 30 1.5
C6-9-2 (2mL virus) 100 ng/µl 30 3
C6-9-3 (5mL virus) 200 ng/µl 25 5
#: 請以autoclaved 0.1X TE Buffer [pH8.0]調整 DNA濃度。
2. DNA純度測定
DNA在純化過程中,容易殘留 RNA、蛋白質或有機溶劑,這些殘留物將會影響 Transfection效率與病毒力價的高低。光譜分析可測出DNA是否含有殘留物,並可測 出 DNA濃度。待客製化病毒之 Plasmid DNA 其 O.D.值必需符合下列條件:
1.
 
Protein contamination test
OD260 / 280 = 1.8 - 2.0
2.
 
Solvent contamination test
OD260 / 230 = 2.0 - 2.4
3. DNA 完整性& Plasmid Size
已知在自然界中,DNA是以 Negatively Supercoiled Form 進行轉錄。Supercoiled form plasmid DNA轉染到細胞中可達到最佳轉錄效率;反之,Nicked DNA or Linear DNA轉錄效率則受到影響。 因此,待客製化病毒之 Plasmid DNA 請以下列方法測試其完整性。另外,請以plasmid上的單一切點限制酶處理DNA,以確認plasmid size是否正確,並將分析結果電泳圖上傳到線上審核單。以下為測試範例與實驗步驟:

範例

Figure legend: 1000ng of plasmid with the size of 9000 bp was linearized with a restriction enzyme (one cutting site). 500ng of linearized plasmid (lane 1) and uncut plasmid (lane 2) were subjected to electrophoresis (0.5% agarose gel with SYBR safe staining, run at 50 volts in 0.5X TBE running buffer) for 2 hours, and then the equal amounts of these two plasmid DNAs are loaded into lane 3 and 4, and ran for another 30-min. Please note that the size of the major band of lane 2 are smaller than 9000 bp, indicating that those DNAs are supercoiled form DNAs in nature. In addition, there are no other signals detected in lane 3 and lane 4 except major band (DNA), suggesting that there are no RNA contaminations in DNA preparation.

附註事項
1. 申請本服務,請至“服務項目訂購”選取C6-9 線上填寫DNA樣本測試結果,申請 shRNA 細菌株萃取之 lentivector 者請務必寫上TRC Clone ID (這是TRC定義的菌株識別碼,每個菌株都有一個唯一的識別碼, 以 "TRCN" 開頭,接著10個數字,此數字串開頭通常有數個0,例如:TRCN0000008763),如是cDNA expressing lentivector, 請填寫基因名稱。待核心評估您的DNA樣本後,將以系統email通知您的DNA樣本是否審核通過。
2. 收到審核結果,將欲製備病毒的DNA樣本勾選加入購物車, 如有需要亦可同時申請病毒濃縮服務(項目編號C6-9-6 or 7)或加購control 病毒(項目編號C6-4) 並完成訂購流程,列印形成之RNAi試劑申請與同意證明單,於計畫主持人、乙方、乙方研發人欄位簽章, 傳真02-27885420或email (RNAiCore@imb.sinica.edu.tw)至本核心。
3. 完成線上訂購流程後就可先寄送DNA樣本(請用1.5mL eppendorf,並包裝妥善以免壓破),請務必根據所申請病毒體積調整DNA濃度,並於管子上標示與申請單上相符之DNA名稱及調整後的DNA濃度(i.e. 50ng/ul, 100ng/ul or 200ng/ul)。如管子上未標示DNA濃度又未依規定調整濃度,導致病毒包裹效果不佳 (低titer或無titer),申請者均需付費。
4. 病毒製備流程需經兩周連續的五個工作天(一個星期生產病毒,另一個星期測定病毒力價)。
5. 收到已簽章的同意單後,本核心將email繳費通知給計劃主持人及聯絡人。 在領取病毒前,需完成繳費。
6. 病毒製備完成後將以核心系統 email 通知領取,因生物安全考量,病毒無法郵寄,請自行到本核心領取。
7. 領取病毒時請攜帶繳費收據影本並自備乾冰及保麗龍盒,如需本核心代購乾冰請來電預訂。 乾冰及保麗龍盒只有在星期一及星期四的中午送達,需要在前一天預訂。
DNA樣本請寄送到以下地址(避開週末送達):
台北市南港區115
研究院路二段128號
中央研究院
基因體研究中心
RNAi Core 4L09A

聯絡
信箱: RNAiCore@imb.sinica.edu.tw (請注意大小寫需相符)
傳真: 02-27885420
電話: 02-27899724, 02- 27898763, 02-27899856
行政相關問題: 鍾穎麗 分機 15
實驗相關問題: 許真妮 分機 11
 

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