產品簡介

RNAi library includes about 150,000 lentivirus-based shRNA reagents targeting 16,000 genes of human and mouse respectively. The shRNA constructs, which are based on pLKO.1 backbone (with ampicillin selection marker) that can support production of VSV-G-peudotyped shRNA-expressing lentivirus by co-transfection with pCMVΔR8.91 and pMD.G, were transformed to DH5a bacterium. RNAi core provides the bacterial stock containing the shRNA construct. Lentivirus-based shRNAs transfer vector are used for gene silencing either by transfecting the shRNA construct directly or by transducing the shRNA lentivirus into cells. Stable cell lines could be established by puromycin selection after transduction.

使用需知

1. 所有訂購之細菌株均為 96 well plate format
2. 細菌株均為 15% glycerol stock，體積約為 100μl / well
3. 處理程序：回溫→離心 (2000rpm, 1min) → 撕封膜
4. 請以 streak out 的方式挑選單一菌落，經 16 小時培養之後，單一菌落直徑約為 0.5 mm 大小， 請勿挑選培養
   盤上菌落較大者作液體培養，以防選到變異株； 每一 clone 至少挑選 2 顆菌落，之後萃取質體，並做定序

   （註一）
   若塗佈養菌失敗，可先從 stock 進行少量液體培養後，再以 streak out 方式挑菌
5. 本細菌庫所使用之質體為 pLKO.1 (Amp+) ，生長速度較慢，故建議液體培養時請使用 Terrific Broth

   （TB,註二）

註一：

pLKO.1-puro 轉移載體以 U6 promoter 表達 shRNA，本核心設施使用以下 primers 其中之一定序之：

• LKO_shRNA/F (forward primer)： 5’-acaaaatacgtgacgtag-3’ (for sequencing forward strand of shRNA)
• LKO_shRNA/R (reverse primer)： 5’-ctgttgctattatgtctac-3’ (for sequencing reverse strand of shRNA)

shRNA 因有二級結構，本核心設施建議定序方法如下：

• 請在樣品中加入5% ~10% DMSO，定序之；或
• 請定序中心以 dGTP BigDye V1.1 kit 或類似產品定序之

二級結構有解開

（ 點擊圖片可放大 ）

二級結構沒解開

（ 點擊圖片可放大 ）

註二：

Terrific Broth 配方，正確配法請參考 Molecular cloning

Tryptone	--------------------------------	12g / L
Yeast extract	--------------------------------	24g / L
Glycerol (100%)	--------------------------------	4ml / L
KH24	--------------------------------	2.31g / L
K24	--------------------------------	12.54g / L

Ampicillin or Carbenicillin final concentration：100mg / L

＊當您的實驗室開始使用細菌株進行實驗後，如果有【定序】、【Knockdown結果】或【論文發表】時，請feedback至本核心設施，俾使整合shRNA database或將成果(論文)呈報到MOST，謝謝合作

• C6-1-1 product is contained in 96-well plate format with 100μL volume for each clone.
• Bacteria (DH5a) are frozen in 15% glycerol stock.
• Recover the plate in room temperature → centrifuge (2000rpm, 1min) → unseal the plate → mix the bacteria glycerol stock gently → take 3-5μL to Luria broth (LB/Amp+) → incubate bacterial culture at 37°C for 12-18 hr in a shaking incubator.
• Obtain the bacteria culture with loop/ tip → gently spreak the bacteria over the LB agar plate(Amp+) → incubate LB agar plate at 37°C for 12-18 hr → pick 2-3 single colonies to Luria broth (LB/+amp) and culture at 37°C o/n → plasmid DNA extraction → sequencing check.
• If plate or broth inoculated from C6 Core bacterial stock shows no growth after incubation or unexpected sequencing data, please give us feedback and we’ll replace the new clone for free.

Sequencing primer (use either one only)：

• (1) LKO_shRNA/F (forward primer)：
• 5’-acaaaatacgtgacgtag-3’ (for sequencing forward strand of shRNA)
• (2) LKO_shRNA/R (reverse primer)：
• 5’-ctgttgctattatgtctac-3’ (for sequencing reverse strand of shRNA)

Protocol for sequencing through the secondary structure of the shRNA hairpin structure：

• (1) Add 5%-10% DMSO to each sample.
• (2) Remind sequencing center of the secondary structure sample.

Secondary structure is resolved.

Secondary structure problem.

A single colony should look like a white dot growing on the solid medium :

pLKO.1(Amp+) is low copy plasmid number plasmid. You can use Terrific Broth (TB) to improve the yield of plasmid DNA from E. coli.

Tryptone	12g / L
Yeast extract	24g / L
Glycerol (100%)	4ml / L
KH 2 PO 4	2.31g / L
K 2 HPO 4	12.54g / L

Ampicillin or Carbenicillin final concentration：100mg / L

Please send us feedback when the knock down efficiency data is completed or the results are published in journal, C6 core will collect the results to MOST, thank you.

技術支援

shRNA定序引子 (primer sequence for shRNA sequencing)，請參閱

產品簡介

Plasmid DNA 產品分為三大類，分述如下：

1. VSV-G-pseudotyped lentivirus 包裹質體 (package plasmid)。其中，pCMVDR8.91提供包裹所須的Gag、Reverse Transcriptase與Rev蛋白；而pMD.G則提供VSV套膜蛋白 (Vesicular Somatitis Virus envelope protein) 以取代HIV的套膜蛋白。pAS2.EGFP.puro轉移質體提供做為包裹病毒時之正對照組 (positive control)，將轉染後之細胞培養液感染宿主細胞，如細胞會表達YFP螢光蛋白，表示pCMVDR8.91、pMD.G、與pAS2.EGFP.puro等三質體轉染細胞後產生具感染力的VSV-G-pseudotyped lentivirus
2. Lentivirus-based shRNA表達轉移質體 (pLKO_AS1系列質體)。請見質體資訊詳細說明
3. Lentivirus-based cDNA或基因表達轉移質體 (pLKO_AS2系列質體)。此系列質體皆為bicistronic mRNA expression vector。第一個蛋白由CMV啟動子轉錄之cap-dependent mRNA轉譯；第二個蛋白則以EMCV的IRES（cap-independent）調控轉譯。Hygromycin，neomycin，zeocin，puromycin，blasticidin，及 EGFP等五基因/ selection markers，已分別接入pLKO_AS2之EMCV IRES後端，得到五種pLKO_AS2之衍生物。因此，此五種selection markers配合VSV-G-pseudotyped lentivirus感染細胞的方式，可以快速的得到細胞穩定株 (stable cell line)

技術支援

1. shRNA construct
• shRNA construction-I: PCR method 【 Protocol : shRNA construction PCR method 】
• shRNA construction-II: annealing method 【 Protocol : shRNA construction annealing method 】
• Method of cloning shRNA using selection marker other than puromycin 【 Protocol : Method of cloning shRNA using selection marker other than puromycin 】
2. sticky_end PCR，請參閱 【 Protocol : sticky_end PCR 】
3. Sequencing Primer，請參閱 【 Protocol : Sequencing Primer 】
4. Purification of Plasmid DNA，請參閱 【 Protocol : Purification_of_Plasmid_DNA 】
5. Suggested Competent Cell：One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli (invitrogen)【 Stbl3 】

產品簡介

本核心設施提供高力價、可表達shRNA的VSV-G pseudotyped lentivirus，此類病毒具廣泛細胞向性，可感染大部分實驗室培養的哺乳類細胞株。請參閱TRC已測試可感染的細胞株【 TRC Protocol : Infectable cell lines for lentivirus 】

各產品簡介如下:

1. 盤式VSV-G pseudotyped lentivirus (C6-2)
• 產品說明：依照TRC基因功能分類，將具相同標地基因的shRNA clones挑選出並整合在一起，如：kinase and phosphatase（激酶與去磷酸酶），並製備成感染細胞後可表達shRNA 的VSV-G pseudotyped lentivirus。而 control virus set則是含有85株不會標地人類與老鼠基因的shRNA，適用於RNAi實驗的負對照組
• 產品規格：病毒存放於96孔盤，各孔洞帶有特定的shRNA，含量為60 mL，每盤約有87株不同的shRNA
• 產品應用： RNAi arrayed screen
2. 混合型VSV-G pseudotyped lentivirus (C6-3)
• 產品說明：依照TRC基因功能分類，將具相同標地基因的shRNA clones挑選出並整合在一起，如：kinase and phosphatase （激酶與去磷酸酶），並製備成感染細胞後可表達shRNA 的VSV-G pseudotyped lentivirus，並將約可標地180個基因的病毒混合成單管
• 產品規格：病毒存放於冷凍管內，每管約有900個shRNA clones，含量為1 mL
• 產品應用：RNAi pooled selection
3. 混合型82K Human VSV-G pseudotyped lentivirus (C6-10)
• 產品說明：本產品主要收集針對TRC1 16,368人類基因(約81,925shRNA clones) 製備成感染細胞後可表達shRNA 的VSV-G pseudotyped lentivirus 詳細資料請參考:【 82K Human pooled lentivirus library 】
• 產品規格：病毒存放於冷凍管內，每管約有8500個各式shRNA clones，含量為0.2 mL，病毒力價約5X108 RIU/ml，共10管
• 產品應用：RNAi pooled selection
4. 單株VSV-G pseudotyped lentivirus (C6-4)

shLuc Virus

• 產品說明：此病毒製備自 TRCN0000072246 與其它shRNA 庫中的病毒具有相同的架構，能針對螢火蟲冷光酶(Firefly luciferase gene) 做專一性抑制
• 產品規格：病毒存放於冷凍管內，每管含量為1 mL
• 產品應用：
• 以螢火蟲冷光酶做為報導基因的系統中，此病毒可作為positive control
• 而在其他不具有螢火蟲冷光酶的系統中，可作為 negative control
• 可作為定量病毒時的標準病毒 (Standard virus)，詳盡的病毒相對定量說明請參考【 TRC protocol : Estimation of lentivirus titer 】
• 可測試實驗細胞株對VSV-G-peudotyped lentivirus的感受性 (susceptibility)，做法與定量病毒相對量的實驗相同

GFP virus

• 產品說明：此病毒與其它shRNA 庫中的病毒具有相同的架構，感染細胞後能表現綠螢光蛋白（green fluorescent protein）
• 產品規格：病毒存放於冷凍管內，每管含量為1 mL
• 產品應用：經此病毒感染後，可由綠螢光訊號之判斷以得知實驗用的細胞株是否被慢病毒感染。附註：此病毒帶有puromycin selection marker，故可在puromycin篩選下存活

使用需知

1. 操作範圍：請以P2 Plus操作規範執行實驗，接觸過病毒的試管等耗材，皆須浸泡於10%漂白水20分鐘後，才能自生物安全櫃移出並進行滅菌處理；詳細的操作規範請參閱 【 生物安全守則 】
2. 病毒的保存：建議於第一次解凍後，視實驗需要進行小量分裝並保存於-80℃冰箱，以減少病毒活性的損失。此外，管裝病毒建議於冰上或4℃解凍；盤式病毒於4℃或室溫下解凍，解凍後採低速離心，再進行開封，以防止污染。有關解凍次數對病毒活性的影響，實驗過程中，病毒可置於室溫，一旦實驗完成，建議立即將病毒置於-80℃冰箱保存。請參閱【 常見問題 > 慢病毒相關 - Q2 如何保存 VSV-G pseudotyped lentivirus 】

技術支援

1. 病毒感染法 (TRC protocol : Lentivirus infection V3, V4 ; For pooled virus screen) : 【 Large scale infection 】
2. 病毒力價測量法
• RIU (Relative Infection Unit) Method 【 protocol: Estimation of lentivirus titer RIU 】
• CFU (Colony Formation Unit) Method 【 protocol: Estimation of lentivirus titer CFU 】
• GFP (Green Fluorescent Protein) Titering Method 【 protocol: Estimation of lentivirus titer GFP 】
3. 不同細胞株之病毒力價轉換法，請參閱【 常見問題 > 其他 - 病毒力價測定方式比較 RIU vs. CFU 】

產品簡介

1. Thermo Fisher Cellomics ArrayScanR VTI HCS Reader是一套自動螢光影像擷取分析系統，可搭配不同螢光染料進行個別細胞之多重影像分析，搭配自動送盤機器手臂，適用於高通量、高內涵篩選實驗(High Throughput Screening, HTS、High content screening, HCS)，例如RNAi genetic screening；此儀器亦可用於一般少量螢光影像分析實驗，以節省人力及避免人為偏見造成影像分析結果偏差。此外，本核心新添購一雲端系統 (Columbus)，方便使用者可在有網路連線的地方分析下載實驗結果
2. 此儀器配有的分析軟體(Bioapplications)可自動劃分細胞不同部位(細胞核、細胞質、細胞膜)，並計算各個部位的螢光表現量。而除了計算全部的螢光表現之外也可特別計算點狀(spot)螢光，因此可分析細胞內點狀物質，像是internalized receptors, multi-protein complex, lipid globules, specialized endosomes, other organelles and cellular fragments等；此外，針對特定實驗也有設計個別的分析軟體，例如G protein-coupled receptors(GPCR), Cell Motility, Cell Spreading, Cytotoxicity, Cell cycle, Colony formation, Micronucleus assay, Cytoskeletal rearrangement, Myotube formation, Neurite Outgrowth, Angiogenic Tube formation等，不需花時間設定複雜的演算法即可做影像分析
3. 凡螢光特性類似於以下的螢光物質(fluorophores)皆適用於本儀器： Hoechst33342, FITC, TRITC, Texas Red, and Cy5

使用需知

1. 第一次使用請先填寫使用申請單，或直接與儀器操作人員(02-27899724 ext 17徐小姐)預約時間討論實驗內容與分析方式，分析條件可由儀器操作人員協助設定；經儀器操作人員教育訓練認可後user可自行操作儀器
2. 樣本由user準備，本核心不做樣本製備，且不負樣本保管責任
3. 儀器開放時間為非假日AM9:00~PM5:00，user需至少於一天前與儀器操作人員(02-27899724 ext 17徐小姐)預約使用時段；如需於其它時間使用，user必須先經儀器操作人員教育訓練認可，且經本核心同意後才可使用其他時間
4. User的ArrayScan原始檔可儲存在本儀器配備的伺服器上，但本核心不負保管責任；因原始檔資料量龐大，建議user以外接式硬碟(自備)或燒錄DVD方式隨時自行備份原始檔
5. 本服務依使用儀器時數計費，於月初統計上個月使用時數並e-mail給user “C6-5同意單送件及繳費通知”，請user依照信件內容申請服務及繳費

產品暨服務簡介

CRISPR/Cas 相關產品暨服務區分為五大類，分述如下：

1. Two vector system: sgRNA expression vectors (C6-8-64 ~ C6-8-66) 此系列質體為sgRNA表現質體。其中，pU6-gRNA.Ppuro (C6-8-64) 載體為lentivector，由U6啟動子調控sgRNA的轉錄，可直接使用於細胞轉染，達到短期表現sgRNA的目標。此質體亦可以包裹成偽慢病毒(VSV-G-pseudotyped lentivirus)，以感染細胞的方式，配合Puromycin抗藥性篩選，可以快速得到細胞穩定株 (stable cell line)。而T3-gRNA (C6-8-65) 與T7-gRNA (C6-8-66) 等sgRNA表現質體，則適用於in vitro transcription之用途。這些sgRNA表現質體皆可以使用BsmBI限制酶移除1.9kb Stuffer sequence, 讓使用者可以自行cloning有興趣的sgRNA protospacer。 C6-8-73 ~ C6-8-75 為sgRNA control 質體
2. Two vector system: Cas9 expression lentivectors (C6-8-52~C6-8-63) 此系列質體為表現Cas9 及其相關蛋白的表現質體。依據其Cas9功能性可以區分為以下五類：
• 雙股DNA剪切(double-strand break; DSB)：表現野生型Cas9蛋白，利用其RuvC-like與HNH內切酶活性進行雙股DNA剪切(詳細說明請見各質體產品資訊：C6-8-52及C6-8-58)
• 單股DNA剪切(nick)：表現突變型Cas9 D10A蛋白或是FokI-dCas9蛋白，利用其nickase酵素活性進行單股DNA剪切(詳細說明請見各質體產品資訊：C6-8-53、C6-8-54、C6-8-59及C6-8-60)
• 基因抑制(suppression)：表現突變型dCas9-KRAB fusion蛋白，利用KRAB repression domain干擾基因轉錄，以達到抑制基因表現的目標(詳細說明請見各質體產品資訊：C6-8-55及C6-8-61)
• 基因活化(activation)：表現突變型dCas9-VP64 fusion蛋白，利用VP64 activation domain活化基因轉錄，以達到加強基因表現的目標 (詳細說明請見各質體產品資訊：C6-8-56及C6-8-62)
• 基因標定(labeling)：表現突變型dCas9-EGFP fusion蛋白，利用EGFP標定基因位置 (詳細說明請見各質體產品資訊：C6-8-57及C6-8-63)
3. All-in-one system sgRNA/Cas9 expression lentivectors (C6-8-67~C6-8-71) 此系列質體為可以同時表現sgRNA及Cas9(或Cas9相關蛋白)的All-in-one表現質體。依據其Cas9功能性可以區分為五類：雙股DNA剪切(C6-8-67)、單股DNA剪切(C6-8-68)、基因抑制(C6-8-69)、基因活化(C6-8-70)、以及基因標定(C6-8-71) 等用途
4. pSurrogate reporter (C6-8-72) 此報導質體包含了表現EGFP蛋白的基因序列(in-frame) 及表現mCherry蛋白的基因序列(out-of-frame)。在EGFP基因序列與mCherry基因序列間設計了限制酶切位，使用者可以將有興趣的sgRNA-targeting sequence (包含PAM) 構築進入此報導質體。在正常表現情況下，只有綠色螢光(EGFP)可以表現，紅色螢光(mCherry)則不會表現。當使用者利用CRISPR進行基因編輯時，Cas9蛋白會在sgRNA-targeting sequence位置上進行剪切，細胞在進行DNA修補過程中有可能會產生indel，mCherry基因序列可能因此轉變成為in-frame，而使紅色螢光蛋白可以表現。使用者可以藉此驗證其sgRNA是否可以產生有效的基因編輯效能，亦可藉此報導質體的表現加速細胞篩選工作
5. Customized CRISPR cloning service (C6-15-1) 本核心備有專人提供CRISPR相關技術諮詢，並提供sgRNA客製化服務。透過與使用者直接溝通的方式，根據使用者的基因標的(eg., cDNA, miRNA or lncRNA)、研究需求(eg., gene knock-out, gene knock-down or gene activation)以及sgRNA標靶位置(promoter, UTR or CDS)，設計符合其需求的sgRNA。針對每一個基因，核心會設計並提供四個不同的sgRNA表現質體以及二個control sgRNA質體。所有本核心所提供的sgRNA表現質體都會經過surrogate reporter實驗驗證, 並提供至少二個sgRNA表現質體可以有效產生indel(analysis by surrogate reporter)的服務保證

技術支援

1. Protocol
• sgRNA construction(Annealing method) 【 Protocol : sgRNA cloning Protocol V1 】
• surrogate construction(Annealing method) 【 Protocol : Surrogate cloning Protocol V1 】
2. CRISPR Introduction 【 CRISPR Introduction V1 】
3. CRISPR technique supports 【 CRISPR technique supports V1 】

產品分類

Type of Cas9 Function	Description	ServiceId	ServiceName
Cut	Wild type Cas9 efficiently generates double strand breaks (DSBs) at sgRNA-targeting sequence.	C6-8-52	p5w.Cas9.Pbsd
		C6-8-67	pAll-Cas9.Ppuro
Nick	A mutated Cas9 (nickase version) generates a single-strand DNA break (Nick) at sgRNA-targeting sequence.	C6-8-53	p5w.Cas9 D10A.Pbsd
		C6-8-68	pAll-Cas9 D10A.Ppuro
Interfere	A catalytically inactive Cas9 (dCas9) fused to a repressor domain can knockdown gene expression by interfering with transcription.	C6-8-55	p5w.dCas9-KRAB.Pbsd
		C6-8-69	pAll-dCas9-KRAB.Ppuro
Activate	A catalytically inactive Cas9 (dCas9) fused to an activator or HAT domain can increase or activate gene expression.		近期推出
Visualize	A catalytically inactive Cas9 (dCas9) fused to a fluorescent protein EGFP can visualize specific genomic loci in the living cells.	C6-8-57	p5w.dCas9-EGFP.Pbsd
		C6-8-71	pAll-dCas9-EGFP.Ppuro
sgRNA	Small guide RNA (sgRNA) can guide Cas9 protein to a specific genomic region through sequence complementarity.	C6-8-64	pU6-sgRNA.pPuro
		C6-8-65	pT3-sgRNA
		C6-8-66	pT7-sgRNA
		C6-8-73	pEGFP-sgRNA 1
		C6-8-74	pEGFP-sgRNA 2
		C6-8-75	pLuc-sgRNA
other	Other useful CRISPR-related tools or constructs.	C6-8-72	pSurrogate reporter